本篇文章给大家谈谈构建载体连不上怎么办，以及搭建 载体对应的知识点，希望对各位有所帮助，不要忘了收藏本站喔。 今天给各位分享构建载体连不上怎么办的知识，其中也会对搭建 载体进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

1. 用T4连接酶做载体连接为什么一直连不上
2. 请教分子生物学实验难题:大片段载体有什么好办法能够连上目的片段?
3. t5载体连不上什么原因
4. 当载体与目的基因连接不上时,应该怎么去进行载体优化
5. 启动子扩出来后连克隆载体连不上

1、用T4连接酶做载体连接为什么一直连不上

平头连接本来就没有粘性末端连接容易，一般我们永T4连接的话是16度过夜，成功率很高。也可4度冰箱放久点。说明书说25度也是可以的，我们一直没有试过。

很显然你的质粒没有构建成功。感觉是连接出了问题，pBI121载体很大，回收比较困难，建议你测一下回收后的浓度。如果太低的话，建议加大酶切量。

用水补足体积。此外，还有一点，平末端连接失败的主要原因是载体自连很严重，你可以用磷酸酶处理载体，将载体去磷酸化，也就是去除载体末端的磷酸集团，这样可以大大降低载体自连概率，增加链接成功率。

如果是PCR直接获得的片段，连接到T载体，则需要确认片段是否有A尾，如果是用高保真酶扩增的，有些高保真酶不加A尾，需要有一个专门加A的过程再继续连接。

如果是这种情况，那么问题有可能是在酶切后回收这一步。回收后的DNA质量直接影响到之后的T4连接酶作用和细菌转化。

2、请教分子生物学实验难题:大片段载体有什么好办法能够连上目的片段?

重新换个接头，用新的连接酶，梯度调整酶浓度和Buffer PH 及其离子浓度。

片段略长了些，增加了连接的难度，建议连接时控制一下载体和片断的摩尔比例1：3～1：10，载体的量尽量少些。

我们通常用老办法，一个一个往上连，如果目的基因不大，可以先把片段叠在一起再连上去。当然，也有人用同源重组的载体一次连几个片段上去。

选择/检测插入片段：为了鉴别质粒中是否含有插入片段，对一些载体进行了工程改造，这样产生的多位点接头的分离会引起可见的表型。

3、t5载体连不上什么原因

转化效率低：转化效率低是导致载体无法连接扩增后的DNA的主要原因之一。如果转化效率低，那么细胞中接受DNA的数量会减少，从而降低了连接的概率。

电脑驱动问题：电脑缺少驱动程序或驱动版本不匹配都会导致打印机无法连接电脑，需要更新相应的驱动程序。

连接线路错误：电脑连上打印机时，连线一定要正确、稳固，通常要插入USB端口，但有时可能会连接错误的端口。检查连接线路是否正确，并重新连接一次。打印机未开启：打印机未开启时，电脑连接打印机也是不会成功的。

由于平末端克隆试剂盒一般小贵，所以我把某个试剂盒提供的载体改造了，只要用EcorV酶切就是平端载体，如果用Eam1101I酶切就是T载体。嗯。这样就不用再买T载体或者平端载体了。哇咔咔。

如果以上都排除，建议换一下连接酶试一下，当然，载体的质量也需要检查。如果连接产物电泳后，确实发现连接成功了，但是转化却不成功，那就要考虑筛选的抗性，表达的蛋白是否有毒性等问题了。先一步步看看吧。

4、当载体与目的基因连接不上时,应该怎么去进行载体优化

为了防止目的两端及载体的两端连接在一起，可以用两种限制酶切割目的基因两端，同时也用这两种限制酶切割载体，这样就能形成两种黏性末端，同时也能防止目的基因和载体的自连。

如果还是不行，就试试对载体去磷酸化，每一步处理都要在结束后热变性，失活残留的酶，适当加大目的基因的量（10以内），连接温度也可以在4-16度内用PCR做个梯度！不过如果有平末端的，就不用做这个梯度了。

第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；（人教版高中生物选修3中提到的E·coliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。

首先，要选择合适的启动子并改进其活性，用以调控目的基因特异性表达。目前在基因工程中多采用特异性启动子，如组织特异性启动子，环境响应启动子及化学诱导启动子等，同时还要对特异性启动子序列进行加倍增强子序列。

5、启动子扩出来后连克隆载体连不上

原因：软件冲突导致。宽带帐号过期。IP设置不正确。猫或路由器有问题。解决方法：下载并运行“百度电脑专家”进行修复。打联通客服，进行人工咨询，看是否欠费。

无缝克隆大片段连不上的原因：PCR产物不纯。反应体系中DNA浓度太低。不纯的载体或插入片段抑制重组反应优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。解决方法是确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。

手机克隆一直连接失败原因如下：两台手机没有处在同一局域网内。手机未开启查找本地设备权限。系统版本过低，和手机系统不兼容。手机克隆的优点：快速备份手机数据该应用程序允许用户快速备份手机上的数据。

当载体与目的基因连接不上时，应该去进行载体优化：目的基因具有从起始密码子到终止密码子的方向性，必须正向连接才能获得正确克隆，构建的载体才能正确表达目的蛋白。相同的限制性核酸内切酶及DNA连接酶。

到此，以上就是小编对于构建载体连不上怎么办的问题就介绍到这了，希望介绍关于构建载体连不上怎么办的5点解答对大家有用。