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1. [实用技巧] 构建基因过表达载体之设计引物详细步骤

1、[实用技巧] 构建基因过表达载体之设计引物详细步骤

植物转基因载体和这些酶都是非常常用的试剂。载体构建好之后需要把它们导入大肠杆菌中复制，这里就要用到大肠杆菌的感受态了，十把构建好的载体和感受态混合，然后放到42度热水处理个1分钟，再冰上放个3分钟。

再设计下游引物：因下游3’端有连续22个A，若算入，则Tm值和GC含量均不达标。因此，在引物设计时，去掉尾部部分A序列，输入尾部序列，点击“反向互补序列”，插入XbaI位点，得到TTTTTGTTTGACTTTGTGTTTATTTTTAAT，Tm=50℃。

使用pEGFP-N1载体，选择F-Hind Ⅲ和R-Kpn Ⅰ作为酶切位点，确保与mRNA的起始和终止密码子相匹配，如图略所示。DNAstar的MegAlin工具帮助我们确定CDS区的ATG（179）和TGA（879）位置。

如果t载体上没有表达载体上需要的酶切位点，就要重新设计带酶切位点的引物，PCR扩增t载体后酶切并连表达载体。如果t载体上有需要的酶切位点，直接酶切后回收目的片段，连接表达载体即可。

不同应用场景的引物设计普通PCR：使用设计工具如PrimerGeneious等，保证产物大小适中。表达载体引物：如构建PCMV-TAG2B-gata4载体，需确保起始密码子位置正确，避免移码突变。

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